从基因挖掘到验证，科研界“最强大脑”告诉你怎么做！
科研思路是科学研究的灵魂。有人说，我每天都能提出几个研究思路，可惜没有人帮我实现。有人说，我想到的所有思路都发现被别人做过了。其实这些情况都反映出这样一个问题，研究思路不稀奇，好思路才难得。
为什么混科研圈的，总是要经常关注科研大牛们的动向，因为他们严谨而富有创新的科研思路往往代表着该领域的最前沿，他们是科研界的“最强大脑”。科技君近期拜读了一篇中科院上海植生所国家基因研究中心团队发表在《Nature Genetics》上，研究水稻籽粒大小分子机制的文章。不禁为其严谨的科研思路赞叹，作为基因挖掘以及进行后期验证的经典范例，下面科技君就带你看看大牛是怎样想又如何做的？
1、GWAS分析定位粳稻粒长和粒重相关位点
381个广泛来源的粳稻品种包含40个热带品种和341个温带品种（之前已经进行过测序，测序深度~1X），利用混合线性模型进行GWAS研究检测此群体的粒长相关位点，只在Chr7上检测到一个位点。关联分析检测到的关联度最大的SNP（）相关的两个主要的单倍型-大粒单倍型()和小粒单倍型（SGH），他们与粳稻的大粒和小粒性状相关。并且大多数的热带粳稻具有LGH单倍型，大部分的温带粳稻为SGH单倍型。粳稻地方种的LD在100kb-200kb衰减，GWAS分析获得的260kb区间预测有11个基因（Figure1a）。
Figure1. 籽粒大小GWAS分析结果
2、候选基因验证
随机筛选大粒和小粒粳稻品系各10个，利用qRT-PCR检测这11个基因的表达水平，基因 即 OsSPL13 在大粒和小粒的品系间表达水平差异显著（Figure1c、d），预测 就是 GLW7 中的候选基因。OsSPL13蛋白属于SBP家族转录因子，为了验证 蛋白水平在粳稻自然群体中是否与籽粒大小相关，研究人员在24个大粒和24个小粒品种的穗子提取蛋白。利用OsSPL13多克隆抗体，检测到OsSPL13在大粒品种中表达水平高于小粒品种（Figure1e）,说明OsSPL13蛋白与籽粒大小性状有关联。
3、OsSPL13基因结构研究
为了研究功能等位基因变异信息，对26个小粒和21个大粒粳稻品种的基因进行测序，测序结果表明该基因可以分为两个单倍型OsSPL13LGH 和OsSPL13SGH分别控制大粒和小粒性状。两个单倍型间只有16-29个多态性位点与rs19784266关联紧密。6个SNP位于启动子区（Figure2a），3个多态性位点在5’UTR,在两个单倍型的编码区没有发现有意义的多态性位点。
4、OsSPL13基因功能验证
为了验证影响表型的位点来源于启动子区还是UTR，构建转基因植株（Figure2b），发现5’UTR的串联重复影响OsSPL13基因表达。最终发现OsSPL13基因的5′ UTR区存在一个串联重复CCATTC 是GLW7在不同粳稻中籽粒效应不同的主要原因，两个CCATTC拷贝引起OsSPL13低水平表达，导致籽粒小。
利用RNAi抑制OsSPL13基因在小粒粳稻品种Dongjing稻和大粒品种GP579中的表达（Figure. 3a,b,d,e），发现与野生型相比千粒重、粒长和籽粒厚度都降低。
为了阐述OsSPL13基因如何调控籽粒大小，在粳稻Dongjing稻的突变库中筛选了一个在OsSPL13内含子区有T-DNA插入的突变体。glw7突变株明显籽粒产量、粒长和籽粒厚度与野生型 Dongjing稻比都有所降低（Figure. 3c）。将Dongjing稻中8Kb的OsSPL13基因转入glw7突变体中，籽粒表型与Dongjing稻无异（Figure. 3d）。
检测突变体和转基因植株灌浆速率，受精后8天检测他们的籽粒湿重和干重，发现两者的差异显著，差异值在受精后25天达到最大（Figure. 3f,g）。这个结果表明OsSPL13蛋白在水稻籽粒干物质积累过程中发挥着重要的作用。
Figure3. Dongjing稻、转基因和突变体籽粒形状分析
OsSPL13同样在稻穗发育过程中有着重要的作用，constructs I, CP 和III转基因植株稻穗长度和分支数量相较Dongjing稻有提高。同时glw7突变体和 Dongjing RNAi-1植株无论是穗长、分支数量和每穗的籽粒数量都大幅降低。
5、OsSPL13基因作用机制
扫描电子显微镜结果展示在glw7突变体和Dongjing稻间成熟籽粒的淀粉颗粒性状间差异很小。在Dongjing稻籽粒发育相较于茎杆发育过程，OsSPL13 转录本和蛋白水平明显提高，glw7突变体中没有检测到OsSPL13蛋白().检测了成熟籽粒外皮的细胞数和细胞大小后，发现glw7 突变体、Dongjing 稻和constructs CP 、III转基因稻间外皮的纵轴线上细胞数并没有区别（Figure. 4c,d），说明GLW7能提高粒长来源于细胞扩张而不是细胞数增多。将籽粒外壳分为上中下三部分（Figure. 4c）去衡量外稃的细胞数和细胞密度。突变体在外稃纵轴线上每毫米的细胞数都显著要高于Dongjing稻(Figure. 4e), constructs CP 和III转基因植株中细胞密度明显降低很多。所有的结果揭示了OsSPL13通过激活细胞大小调控机制以调节籽粒形状。
Figure4. OsSPL13转录本和蛋白水平变化与籽粒外壳中细胞大小关联分析
OsSPL13在颖花发育阶段特异性表达。并且OsSPL13基因是OsmiR156的靶基因。利用ChIP-qPCR分析发现SMALL AND ROUND SEED 5 () 可能是OsSPL13直接作用位点。编码α-微管蛋白，SRS5上的一个氨基酸置换（p.Arg308Leu）通过改变细胞延长而降低了籽粒长度。进一步的研究表明Dongjing稻和转基因植株中的SRS5转录水平比glw7突变体显著要高。这些结果表明蛋白直接作用于SRS5基因，并具有上调的效果。ChIP-qPCR结果同样发现蛋白能与DEP1基因的启动子区结合，DEP1是已知的调节穗长和籽粒数量的基因。利用qPCR比较四个扩张蛋白相关基因OsEXPA2、β-expansin precursor、OsEXPA4和OsEXPA16转录水平，发现四个基因在Dongjing稻表达水平都高于glw7突变体。这些结果表明OsSPL13蛋白作用是参与细胞大小调控。
GLW7 和GS3分别独立调控籽粒形状。
原来的研究发现qGS3是控制水稻粒长的主效基因，序列分析显示Dongjing稻含有全长且具有小粒性状，当通过RNAi降低GS3基因的表达，粒长有所增加。我们利用GS3-RNAi-2和 CP-1 转基因植株，GS3-RNAi-2 和glw7突变体分别杂交构建F2群体，CP-1 × GS3-RNAi-2杂交获得最重、最长的籽粒。转录分析发现OsSPL13基因表达水平在GS3-RNAi植株中并没有发生改变，同样GS3基因在glw7突变体和CP-1转基因植株表达水平也没有发生改变。所以推断GLW7 和GS3基因是分别独立调控籽粒形状。
下面我们梳理一下整体的研究思路：在最初利用GWAS检测到粒长QTL候选区间后，通过对该区域基因组信息的解读发现了11个候选基因；11个基因在粒长性状差异显著的样本间进行基因和蛋白的差异表达研究，最终确定了目标基因为OsSPL13；对OsSPL13基因测序以明确其详细结构特点和多态性；然后通过转基因、RNAi抑制基因表达和构建突变体来进一步验证基因功能，判断OsSPL13基因是否真的控制粒长性状；在基因得到验证后，从细胞水平、基因表达水平和蛋白互作水平深度挖掘了基因作用的机制，了解OsSPL13基因是通过什么样的方式调控粒长性状。
整体研究思路很好的解释了是什么？怎么样？真的吗？如何作用？这几个问题。把我们考虑到的或是没考虑到的都做了，全方位的验证和解析使得结果更让人信服。
在科研领域，研究一个科学问题往往要从不同的层面多角度进行，华大不仅提供DNA、RNA、蛋白以及表观水平的科研服务，而且可以根据科研目的提供适宜的研究方案，一站式解决所有问题。
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文章来源：
Si L, Chen J, Huang X, et al. OsSPL13 controlsgrain size in cultivated rice[J]. Nature Genetics, 2016.doi:10.1038/ng.3518
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